1樓：匿名使用者
基因克隆
bai的方法主要有哪du幾種
選擇目的基因zhi,並設計相應引
物dao；版
用引物pcr擴增目的基因片段權；
選擇合適（抗性標記、酶切位點等）的克隆載體（為了保真擴增）,並將pcr片段連線入克隆載體中；（一般用taq酶的pcr產物在末尾會自帶一個a,可在solution 1作用下與兩端各帶一個t的線性t載體直接相連）
將連線產物轉化入感受態大腸桿菌,使之在含有抗生素的培養基上生長擴增；
從大腸桿菌中提取質粒（即前面的連線產物）,酶切鑑定和測序鑑定均無誤後將目的基因片段切下並與新的表達載體連線,然後再次轉化入大腸桿菌中擴增,再提質粒,即得到想要的目的基因片段克隆.
基因克隆的常用方法有哪幾種？
2樓：匿名使用者
根據已知探針克隆基因
這也是基因克隆的一種較直接的方法。首先將探針作放射性或非放射性標記,再將其與用不同內切酶處理的基因組dna雜交,最後將所識別的片段從膠中切下來，克隆到特定的載體(質粒、噬菌體或病毒)中作序列測定或功能分析。這種方法不但可以將基因克隆出來,還能同時觀察該基因在基因組中的拷貝數。
但在探針雜交後,要注意高強度(high stringent)漂洗,以避免干擾訊號,即保證克隆的特異性,同時節省時間。
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基因克隆的方法有哪些
3樓：匿名使用者
簡單的說一下：
擴增目的基因，比如通過pcr的方法。
pcr擴增的序列可以通過酶切或者topo ta的方版法插入到載體質權粒。
轉染大腸桿菌
篩選陽性克隆一般常採用藍白克隆方法，就是在載體上，序列的插入位置本來是一個完整編碼β-gal這個酶的序列，如果不被破壞，產生的酶可以降解細菌培養盤上的底物，形成藍色產物。如果有目的序列插入，這個酶就不能表達，形成的克隆就是白色的。
挑取陽性克隆，測序確認無變異和方向後，擴增質粒，提純質粒。
目標基因克隆的主要方法有哪些
4樓：莫彷徨
基因克隆技術包括了一系列技術，它大約建立於70年代初期。美國斯坦福大學的伯格（p.berg）等人於2023年把一種猿猴病毒的dna與λ噬菌體dna用同一種限制性內切酶切割後，再用dna連線酶把這兩種dna分子連線起來，於是產生了一種新的重組dna分子，從此產生了基因克隆技術。
2023年，科恩（s.cohen）等人把一段外源dn**段與質粒dna連線起來，構成了一個重組質粒，並將該重組質粒轉入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。
一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主複製能力的載體dna在體外人工連線，構建成新的重組dna，然後送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組dna技術以及基因工程等。
採用重組dna技術，將不同**的dna分子在體外進行特異切割，重新連線，組裝成一個新的雜合dna分子。在此基礎上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程叫基因克隆。
基因克隆技術的原理與方法是什麼？在醫學上有何意義
5樓：悠悠我心
通過體細胞進行無性繁殖後代遺傳基因與母體完全相同克隆得到個體或單個器官其基本過程為：提取母體的體細胞核移植到除去細胞核的卵細胞中,通過刺激手段是兩者融合後在營養液中促使**繁殖形成胚胎,植入某個母體的卵巢發育以產生後代.後代的基因由提供體細胞核的母體提供,與提供子宮和卵細胞的母體無關整個過程無精子卵子結合,屬無性繁殖
基因克隆的基本步驟有哪些
6樓：阿樓愛吃肉
基因克隆的基本步驟流程如下：
一、目的dn**段的獲得：
dna克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群dna分子，這些dna分子或來自於目的生物基因組dna或來自目的細胞mrna逆轉錄合成的雙鏈 cdna分子。
由於基因組dna較大，不利於克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的dna小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組dna 或cdna中通過pcr技術可以獲得目的基因。
二、載體的選擇：
基因克隆常用的載體有：質粒載體、噬菌體載體、柯斯質粒載體、單鏈dna噬菌體載體、噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體、表達載體、測序載體、穿梭載體等。
三、體外重組：
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連線的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割dna分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過t4 dna連線酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連線。
當目的dn**斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連線，但連線效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端dna分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端dna分子通過一些修飾；
如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，pcr法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連線，此為修飾黏末端連線。
四、匯入受體細胞：
載體dna分子上具有能被原核宿主細胞識別的複製起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中複製，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組dna分子。
五、重組子的篩選：
從不同的重組dna分子獲得的轉化子中鑑定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：
（1）插入失活法：外源dn**段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑑定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質粒）。
（2）pcr篩選和限制酶酶切法：提取轉化子中的重組dna分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過pcr技術篩選陽性克隆。pcr法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑑定插入片段的大小。
（3）核酸分子雜交法：製備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（4）免疫學篩選法：獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分orf片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
7樓：抗壓吧務隊團
步驟如下：
1、目的dn**段的獲得
dna克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群dna分子，這些dna分子或來自於目的生物基因組dna或來自目的細胞mrna逆轉錄合成的雙鏈 cdna分子。
由於基因組dna較大，不利於克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的dna小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。
若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組dna 或cdna中通過pcr技術可以獲得目的基因。
2、載體的選擇
基因工程的載體應具有一些基本的性質：
（1）在宿主細胞中有獨立的複製和表達的能力，這樣才能使外源重組的dn**段得以擴增。
（2）分子量儘可能小，以利於在宿主細胞中有較多的拷貝，便於結合更大的外源dn**段。同時在實驗操作中也不易被機械剪下而破壞。
（3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特徵（如對抗生素的抗性）。
（4）載體本身最好具有儘可能多的限制酶單一切點，為避開外源dn**段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇範圍。若載體上的單一酶切位點是位於檢測表型的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利於重組子的篩選。
dna克隆常用的載體有：質粒載），噬菌體載體，柯斯質粒載體，單鏈dna噬菌體載體，噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。
3、體外重組
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連線的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割dna分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過t4 dna連線酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連線。
當目的dn**斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連線，但連線效率比黏端相連差些。
有時為了不同的克隆目的，如將平端dna分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端dna分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，pcr法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連線，此為修飾黏末端連線。
4、匯入受體細胞
載體dna分子上具有能被原核宿主細胞識別的複製起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中複製，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組dna分子。
將外源重組dna分子匯入原核宿主細胞的方法有轉化，轉染，轉導。重組質粒通過轉化技術可以匯入到宿主細胞中，同樣重組噬菌體dna可以通過轉染技術匯入。
轉染效率不高，因此將重組噬菌體 dna或柯斯質粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，藉助這些噬菌體顆粒將重組dna分子匯入到宿主細胞轉導技術，這種轉導技術的匯入效率要比轉染的匯入效率高。
5、重組子的篩選
從不同的重組dna分子獲得的轉化子中鑑定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源dn**段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑑定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法。
（二）pcr篩選和限制酶酶切法
提取轉化子中的重組dna分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過pcr技術篩選陽性克隆。pcr法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑑定插入片段的大小。
（三）核酸分子雜交法
製備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（四）免疫學篩選法
獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分orf片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
上述方法獲得的陽性克隆最後要進行測序分析，以最終確認目的基因。
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