1樓:匿名使用者
加入裂解液bai的時候顛倒混勻du的動作幅度太大, 會導致基zhi因組dna斷裂成dao小片段,和質粒混
專在一起。 沉澱以後屬,吸取上清液的時候不小心吸入沉澱, 會把夾在沉澱中的基因組dna也一起吸入矽膠吸附柱, 這一步的可能性更大,通常都是這一步混入的基因組dna。
如何以大腸桿菌質粒dna為載體克隆人的p53基因?並作最終鑑定。
2樓:匿名使用者
就是利用基
來因工程
首先源提取目的基因 從細bai胞的信使rna中提du取出p53基因構建基因表zhi達載體
dao 將目的基因p53和載體-大腸桿菌質粒重組將目的基因匯入受體細胞 可以選擇大腸桿菌或動植物細胞作為受體細胞,匯入重組dna
檢測和鑑定 可採用發射性同位素標記法檢測p53
3樓:匿名使用者
方法1;這個蛋白很普遍,應該有相當多的實驗有現成的質粒,直接去求就可以。去回ncbi上搜尋一下,答這類的文章非常多。
方法2:自己構建時,主要將你從人源細胞系中抽提總mrna,然後反轉錄。
將反轉錄的總cdna作為模板,通過pcr 特異的p53引物,克隆出這個基因
然後凝膠電泳分離純化pcr產物;然後將該pcr產物插入到帶有抗性的大腸桿菌質粒中。
塗板後,篩選陽性克隆數個,再用酶切作鑑定,找到合適的質粒;
最後再將該質粒進行測序。確定該質粒無突變。
4樓:亮亮眾裡尋他
首先來是活的cdna:
提取細胞總
源rna→設計引物,反轉錄pcr得到p53的cdna→凝膠電泳並**目的片段→純化→將純化後的片段與t載體連線(16°C 過夜)→轉化jm109感受態細胞→塗布氨苄抗性平板→37°C 過夜培養→挑取轉化子→菌落pcr驗證→電泳分析得到陽性轉化子→將陽性轉化子接種lb培養基37°C培養過夜→收集菌體→提取質粒→得到p53基因的克隆載體。
5樓:忽而一夢
mrna很容易分解的~~~很難提取
如果你能提取到,首先逆轉錄pcr合成cdna將cdna轉入質粒中(用限制性內切酶酶切)再將重組質粒匯入大腸桿菌
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