1樓：匿名使用者
菌種儲存採用甘油種結合超低溫（-70℃）儲存的方法，即用無菌甘油懸浮工程菌，並使甘油終濃度為30 %（v/v），所獲物即為工程菌的甘油種。低溫可使工程菌的生命活動處於非活躍狀態而能較長時間儲存細胞活力、減少基因變異，而30%的甘油可保護菌種的細胞膜系統在冷凍與解凍迴圈中不被破壞而起到保護作用。
製作大腸桿菌感受態細胞時，最後儲存細胞時用甘油好呢？還是用dmso好呢
2樓：匿名使用者
甘油就可以了，dmso是用來保護細胞這種比較嬌嫩的，大腸桿菌就用便宜一點的好了。
希望能夠幫到你~有問題一起討論解決哦~
3樓：匿名使用者
感受態細胞一般都是用甘油就可以了，放在-80冰箱半年內都有效
4樓：匿名使用者
我建議用甘油，但是還要看你個人了
大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌
5樓：阿魯巴星人
ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一種液晶的狀態，這種狀態便於在熱激條件下形成縫隙，便於轉化質粒。
如何製備大腸桿菌感受態細胞
6樓：匿名使用者
（1）挑取大腸桿菌單菌落，接種於5 ml無抗生素的lb液體培養基中，37℃下振盪培養13h，至對數生長後期。將該菌懸液以1:50 的比例接種於100 ml lb 液體培養基中，37℃振盪培養2-3h至od600＝0.
5。（2）在無菌條件下將培養液轉入離心管中，冰上放置10 min，使培養物冷卻至0℃，然後4℃，4000rpm離心10min；
（3）棄去上清，倒置1 min，以便將培養液流盡；
（4）用冰預冷的0.1 mol/l的cacl2溶液10 ml輕輕懸浮細胞，充分混勻，冰上放置30 min後，4℃下4000rpm離心10min；
（5）棄去上清，並倒置1 min，以便最後的痕量培養液流盡；
（6）加入4 ml預冷含15%甘油的0.1 mol/l的cacl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液；
（7）感受態細胞100 μl分裝，貯存於-70 ℃儲存備用。
感受態細胞製備中，加了兩次氯化鈣，它們的作用分別是什麼？
7樓：海貝兒
除了增加細胞通透性之外，第一次還有洗淨之前一步殘留的lb液體的作用
如何製備大腸桿菌感受態細胞
8樓：匿名使用者
大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化
準備：一. 材料
e. coli dh5α菌株: rˉ,mˉ,ampˉ；pbs質粒dna: 購買或實驗室自制，eppendorf管。
二. 裝置
恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恆溫水浴鍋, 製冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.lb固體和液體培養基
2.amp母液
3.含amp的lb固體培養基:將配好的lb固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板。
4.麥康凱培養基(maconkey agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板。
5.0.05mol/l cacl2溶液:稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/l cacl2: 稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
操作步驟：
一、 受體菌的培養
從lb平板上挑取新活化的e. coli dh5α單菌落,接種於3-5ml lb液體培養基中,37℃下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期。將該菌懸液以1:
100-1:50的比例接種於100ml lb液體培養基中,37℃振盪培養2-3小時至od600 ＝0.5左右。
二、 感受態細胞的製備 ( cacl2 法)
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年。
三、 轉化
1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上。
2、 加入pbs質粒dna溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後。
3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml lb液體培養基(不含amp),混勻後37℃振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr )。
5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的lb平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的lb平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
四、 計算轉化率
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：
轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積
轉化頻率**化子數／每mg質粒dna）＝轉化子總數／質粒dna加入量(mg)
感受態細胞總數＝對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用於其它e.coli受體菌株的不同的質粒dna的轉化。但它們的轉化效率並不一定一樣。
有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。
大腸桿菌感受態細胞製備時的cacl2濃度到底是多少
9樓：匿名使用者
（1）質粒dna的質量和濃度： 用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。
對於以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實驗證明，大於30kb的重組質粒將很難進行轉化。此外，重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子。 （2）感受態細胞的質量：
所用的cacl2等試劑均需是最高純度的，並用最純淨的水配製，最好分裝儲存於4℃ （3）細胞的生長狀態和密度 最好從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。不要用已經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳。
即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的od600控制。對tg1菌株，od600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同）。
密度過高或不足均會使轉化率下降。 （二）感受態細胞轉化中的影響： 整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理。
所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所汙染，否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入。整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。
感受態細胞的製備時有什麼注意事項
10樓：天寂無痕
1、培養溫度。較低的溫度培養有利於感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了 inoue 的高效感受態製備方法，它實際是利用了所有有利於感受態的文獻而得出的一
個非常理想方法。
2、在儲存感受態時，dmso 要比甘油的效果要好，它會使感受態的效率增加。
3、液氮速凍也會使感受態的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態，然後儲存於超低溫冰箱內。
4、凍存的感受態用一次拿一管，不要反覆凍融。化凍之後立即使用，不要冰上放太久。
5、操作時可以輕彈輕甩，儘量避免用移液器吹吸。
11樓：y神級第六人
（1）質粒dna的質量和濃度：
用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。對於以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實驗證明，大於30kb的重組質粒將很難進行轉化。
此外，重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子。
（2）感受態細胞的質量：
所用的cacl2等試劑均需是最高純度的，並用最純淨的水配製，最好分裝儲存於4℃
（3）細胞的生長狀態和密度
最好從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。不要用已經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳。
即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的od600控制。對tg1菌株，od600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同）。
密度過高或不足均會使轉化率下降。
（二）感受態細胞轉化中的影響：
整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所汙染，否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入。整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。
大腸桿菌感受態細胞製備時的CaCl2濃度到底是多少
1 質粒dna的質量和濃度 用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5 1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。對於以質粒為載體的重...
大腸桿菌感受態細胞DNA轉化，為什麼沒有克隆菌生長
當然要先用液態不加抗生素的lb復甦好不好。不要糾結在轉化塗板的過程上 要麼就是你的質粒酶切完後 的片段不對 要麼就是你的膠 產物不對 你用什麼酶做的pcr？連t載體末端必須有a 感受態還有沒有用？最好轉個質粒驗證一下，做這個感受態是非常重要的。膠 的時候有沒有把wash buffer 蒸發乾淨？為什...
為什麼製備好的感受態細胞放冰箱過夜後,轉化率會提高
剛製作完成的時候，轉化率最高。然後放入冰箱，只要凍融過，轉化率就會下降，並且隨著儲存時間的增加而下降。製備出來的感受態細胞在什麼時候做轉化最佳 當場做出來的，當時做轉化，轉化效率最高。儲存在 80冰箱的感受態，儲存40天以後，感受態效率會有明顯下降。經轉化的感受態細胞，塗完板後，還有剩餘的菌液，為什...