1樓：百替生物
首先，在設計pcr引物時，結構要好，長度應在20bp左右，避免引物間形成引物二聚體。兩條引物的退火溫度儘量保持一致，最好是在55度左右。
其次，使用的dna模板量是比較關鍵的，應使用純度較高，基因組較完全，沒有產生斷鏈的基因組dna。
然後是pcr體系中各個試劑的使用，比如說酶的純度，活性，並且要注意酶量一定要適中，過尤不及。各dntp的量要保持一致。pcrbuffer中要注意有無新增鎂離子等幫助反應進行的東西。
等等。最後是pcr程式的設定。如果怕一開始就使用一個固定的退火溫度擴增不出來，可以先小批量得試驗溫度梯度，或者用touchdown程式，即先設定一個較高的退火溫度，這樣引物的特異性結合會比較好，然後每個迴圈的退火溫度都比上個迴圈低度或1度，最終停留在某一個較合適的溫度完成整個程式。
pcr反應中有太多細節要注意了。只能在試驗中摸索，進步。
現在也有公司可以代做pcr，省時省力，大大縮短研究週期。
可以來杭州百替生物看看哦！
2樓：匿名使用者
主要是退火的時間以及在pcr中的程式設定，不同的基因片段需要不同的設定哦，這個可以問問帶你的老師。不然可是擴不出來的哦。
3樓：網友
原理：dna雙連複製。
條件：已知目的基因的核苷酸序列，四種脫氧核苷酸，一對引物，dna聚合酶。
過程：dna變性，氫鍵斷開，成單鏈dna
退火，形成區域性雙鏈。
延伸特點：成指數形式擴增。
在做pcr的操作過程中需注意哪些問題
焊接操作過程中應注意哪些安全操作事項？
pcr實驗操作注意事項有哪些
4樓：龍鳳油洺月
實驗操作注意事項：儘管擴增序列的殘留汙染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉汙染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
(2)使用一次性吸頭，嚴禁與pcr產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的汙染。
(3)避免反應液飛濺，開啟反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dntp、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的精確度。
(5)最後加入反應模板，加入後蓋緊反應管。
(6)操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證pcr反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性。
(7)儘可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本dna的汙染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少pcr操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是pcr產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區。
(8)重複實驗，驗證結果，慎下結論。（搬運過來的）
pcr實驗過程中的注意事項
進行pcr實驗時應注意哪些事項？
5樓：歐治國
首先，要確定你的模板dna的濃度大概是多少，太稀和太濃都影響pcr結果，具體資料不記得了，只是我自己跑pcr時因為濃度問題失敗了很多次，通過多次調整濃度才得到較理想的結果。
其次，如果是自己提的dna，要確保模板中沒有酒精（提dna最後一步，一定要等酒精揮發完才能加te）
最重要的是要探索一個好的退火溫度，退火溫度的高低可以以的梯度變化確定，假如參考值為61℃，先跑一次，看結果，如果拖尾很長，則一個一個梯度增加退火溫度，但不能增得太急，我那時次增加5℃，結果跑出來全是很小很小的片段，大概都只有300bp了。
這是我跑pcr的一些經驗，僅供參考。
6樓：飄雪在韓冬
1 儘量保證核酸純淨並控制濃度：濃度太低模板量不足，濃度太高雜質含量也就高，易影響taq酶活性。
2 操作儘量在冰上，傳說taq酶比較脆弱。
3 據說加點bsa可以減少引物二聚體的形成並保護taq酶的活性pcr還是很拼人品啊，畢設那會兒死活p不出來，急死都沒用。。
pcr操作時注意事項
7樓：匿名使用者
太多了，比如一定要有陰性對照，防止汙染帶來的假陽性；退火溫度的設定等等。
pcr的操作注意事項
8樓：匿名使用者
pcr操作注意事項：1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取rna時可加入少許糖原以促進rna沉澱。
例如加800ml trizol勻漿樣品，沉澱rna前加5-10μg rnase-free糖原。糖原會與rna一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響pcr反應。2．勻漿後加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃儲存至少一個月。
rna沉澱可以儲存於75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。3．分層和rna沉澱時也可使用臺式離心機，2600×g離心30-60分鐘。預期產量：
1mg組織或1×106細胞提取rna分別為：肝和脾6-10μg ,腎3-4μg,骨骼肌和腦組織，胎盤1-4μg,上皮細胞8-15μg,成纖維細胞5-7μg
簡述建立pcr反應體系時需注意哪些問題
9樓：從桂花穰凰
pcr時，將rna反轉錄成cdna反應體系怎麼算。
再以cdna為模板進行pcr擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。rt-pcr使rna檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量rna樣品分析成為可能。該技術主要用於：
分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cdna探針、構建rna高效轉錄系統。
rt-pcr即逆轉錄pcr，是將rna的逆轉錄（rt）和cdna的聚合酶鏈式擴增反應（pcr）相結合的技術。rt-pcr技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞/組織中基因表達水平，細胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列等。
10樓：富淑琴殷月
標準的pcr反應體系：10×擴增緩衝液。
10ul4種dntp混合物。
各200umol/l
引物各10～100pmol
模板。taqdna聚合酶。
加雙或三蒸水至。
100ulpcr反應五要素：參加pcr反應的物質主要有五種即引物、酶、dntp、模板和mg2+
引物：引物是pcr特異性反應的關鍵，pcr產物的特異性取決於引物與模板dna互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用pcr就可將模板dna在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：①引物長度：15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。③引物鹼基：
g+c含量以40-60%為宜，g+c太少擴增效果不佳，g+c過多易出現非特異條帶。atgc最好隨機分佈，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3』端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3』端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致pcr失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：
引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。
希望有所幫助。
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