求助流式細胞儀檢測血細胞,全血的貯存方法

2021-03-04 04:29:01 字數 5828 閱讀 3772

1樓:匿名使用者

用於流式檢測的全血需要用edta抗凝(抽血時使用bd的紫色蓋抽血管),抽血後不要冷藏或者冷凍。室溫下儲存24小時內完成檢測。如果血樣超過72小時,就不能再用於流式檢測了。

流式細胞儀檢測的原理

2樓:匿名使用者

很簡單的啊。

流式細胞儀資料分析

5.1 資料採集及顯示

光訊號轉換成電壓脈衝後,再通過模數轉換器轉換成為計算機能夠儲存處理的數字訊號。 流式細胞儀的資料以fsc標準格式儲存,該標準由「分析細胞學協會」制定。

根據fsc標準,資料儲存格式應包括三個檔案:樣本獲取檔案,資料設定檔案和資料分析結果。 4引數(fsc,ssc,fitc和pe)的單細胞分析會生成8位資料。

當單個樣品累計收集到10000個細胞時,fcs資料檔案為80kb。

資料採集儲存完畢後,細胞亞群可以幾種不同格式顯示。單引數如fsc或fitc(fl1)可使用直方圖,橫軸表示熒光通道。縱軸表示在該通道內收集到的細胞數量(如圖5-1)。

處在同一通道的每一細胞均符合該通道的訊號值,而且具有相同的訊號密度。通道右側訊號的熒光強度明顯高於左側,越靠右側熒光亮度越強。 圖5-1 流式資料分析圖

雙引數可在二維散點圖中同時顯示,x軸顯示通道1(fl1),y軸顯示通道2(fl2)。3維圖通過x,y,z三個軸分別顯示每個通道的細胞量(如圖5-1)。

習題:資料採集及顯示

1 在直方圖中橫軸和縱軸分別表示 。

2 二維點圖用於顯示 引數。

3 在cellquest軟體中3維圖中z軸代表 。

5.2 設門

通過設門的方法可以定義細胞亞群的區域。如:血樣本是混合細胞群,如果想單獨分析淋巴球細胞,可根據fsc或細胞大小,在fsc,ssc的散點圖中設門,其資料結果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。

圖5-2 全血樣本中淋巴細胞亞群的資料分析圖

習題:設門

1 設門的方法通常用於分析樣本內的指定細胞。(對 錯)

5.3 細胞亞群的資料分析

資料分析包括從點圖中的list-mode檔案中顯示資料,然後統計點圖中的細胞分佈情況。如前所述,分別有幾種形式的點圖用於顯示資料,而且可通過設門的方法區分指定的細胞亞群。 如圖5-3所示,在淋巴細胞亞群周圍設門,以單獨分析或分選該亞群細胞。

圖5-3 選定淋巴細胞亞群設門

門內細胞的資料結果可在隨後的圖中顯示。在下面的例項中,我們將詳盡闡述細胞亞群百分含量的不同分析方法。 我們可以通過單引數直方圖,二維點圖和三維圖來分析結果。

單引數直方圖可定位邊界,二維點圖可設定象限標誌。如果需要,還可以建立資料統計表以輸出結果。 直方圖可直觀單個引數的細胞數量。

陰性對照用於決定直方圖中單引數的左右邊界(見圖5-4)。左圖中m1為陰性對照峰。右圖中m2為cd3 fitc陽性峰。

圖5-4 陰性對照峰m1(norm001)和cd3 fitc陽性峰m2(norm002) 圖5-5的統計結果表明,整個事件共記錄了6000個細胞,門內淋巴細胞2891個。其中m1(陰性)細胞619個,m2(cd3陽性)細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群cd3陽性百分含量的統計結果為:

m2:2272/2891=78.59%。

圖5-5 直方圖統計結果

二維點圖以雙引數顯示結果,每個點表示一個或多個細胞。圖5-6為陰性對照圖,用於設定陰性對照邊界,全圖劃分為四個象限,以區分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限(ll)為雙陰性細胞,左上象限(ul)為y軸陽性細胞(cd19 pe),左下象限(lr)為x軸陽性細胞(cd3 fitc),右上象限(ur)為雙陽性細胞(cd19+/cd3+)。

圖5-6 陰性對照組(norm001)和cd3 fitc/cd19 pe雙染樣本(norm002) 如圖5-7所示,淋巴細胞亞群雙陽性細胞(cd19+/cd3+)的百分含量為:296/2839=10.43%。

圖5-7 散點圖統計結果 另一個分析方法是劃定區域,也就是設門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區域(如圖5-8所示);然後統計該區域內指定細胞亞群的百分含量。在圖5-9中,r4門內為cd4陽性,cd3陰性的淋巴細胞亞群,其結果為:

40/2866=1.40%。

圖5-8 cd3 fitc/cd4 pe 雙染樣本分析圖 圖5-9 cd3 fitc/cd4 pe 雙染樣本資料統計結果

這種方法在分析不同的供體細胞時存在一個缺陷,因為如果事先定義好細胞亞群的區域或邊界,在隨後的檔案中,下一個樣本的細胞亞群位置會發生變化,這就需要操作者重新調整區域或邊界位置。 為避免這種情況的發生,我們採用一種稱為叢集分析(cluster analysis)的新方法。bd公司的multisettm 和attractorstm軟體就屬於叢集分析軟體。

該軟體的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動,自動變換區域或邊界到相應的細胞亞群位置(見圖5-10)。

圖5-10 使用attractors分析軟體時二維點圖的前後變化對比

5.4 流式細胞儀的其它應用以及資料分析

這些分析方法通常適用於計算離散細胞群的百分含量,對於分析單克隆細胞株分子是否呈陽性並不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群,在大多數情況下,既不是100%陰性,也不是100%陽性,所以我們通過幾何均值法和中位法統計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統計結果遠遠大於陰性對照組,那麼我們認為其結果是陽性的,兩者間的差異越大,說明細胞的表達越高,陽性率越高。

如圖5-11所示,左圖為單細胞群的散射光訊號,右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2,5和20(從左至右)。

圖5-11 單細胞株分析圖 除檢測陽性率,幾何均值法和中位法還用於分子(接合子)定量分析。

quanticalctm軟體就是使用中值法計算每個細胞的抗體結合位點數。如圖5-12所示,y軸上的圓圈代表從標準曲線獲取的資訊,用於計算每個細胞的接合點位數。 圖5-12 使用quanticalc軟體計算每個細胞的抗體結合位點數 我們使用modfit lttm軟體進行dna定量分析。

因為dna峰(g0/g1期,s期和g2m期)不是離散的,所以我們對曲線以下的面積進行積分,以得到每個細胞亞群的百分含量結果。

圖5-13 細胞週期的dna直方圖

習題:資料分析

1二維點圖和一維直方圖的作用分別是什麼?

2 見圖5-4和圖5-5,cd3陰性和陽性的百分含量分別是多少。

3 ll象限代表雙陽性細胞亞群。(對 錯)

4 見圖5-6和圖5-7,淋巴細胞(cd3+/cd19-)的百分含量是多少。

5 只能使用矩形設定細胞區域範圍。(對 錯)

6 使用區域設定法分析樣本有哪些不足。

7 避免細胞亞群移動的分析方法是什麼。

8 在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。

5.5 cellquest和cellquest pro軟體使用

cellquest和cellquest pro軟體是目前運用最為廣泛的流式細胞儀採集及分析軟體。它執行於蘋果電腦上,優質的向量圖顯示使得操作介面特別優美。現最新的微軟公司的vista軟體也是仿蘋果作業系統介面的,可想而知在使用cellquest和cellquest pro時的強大功能及視覺質感。

cellquest和cellquest pro軟體主安裝在bd facscalibur型流式細胞儀上。

1.軟體資料流程

在cellquest和cellquest pro軟體的資料流分為二個部分:方案和資料包。方案是指使用者可以建立採集或分析所需的直方圖或散點圖、設門並定義門與門、門與圖之間的邏輯關係。

可以使用方案進行資料採集或分析以往已有的資料。每個採集方案分析樣本後會生成資料包,該資料包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測引數上的數值,格式為fcs2.0或fcs3.

0。資料包必須由方案檔案開啟,無法單獨顯示,或者可由第三方軟體進行分析,如winmdi。

2.軟體與儀器的連線

流式細胞儀需要加電開啟後會向計算機發出資訊,所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀,然後再開啟計算機。

1、 先開儀器後開計算機,以確保儀器和計算機之間的正常通訊。

2、 在蘋果選單下點選cellquest和cellquest pro軟體。

3、 從aquire選單下選擇con*** to cytometer。

3.方案與資料之間的關係

cellquest和cellquest pro軟體的方案與資料相互獨立儲存,資料包可以由任一方案檔案進行分析,分析後不改變資料包中的任何資料。cellquest和cellquest pro軟體中方案內的直方圖或散點圖有三種狀態:acquire,analysis和acquire-analysis。

當圖的屬性為acquire時,此圖只限於採集下用,即只當進行檢測時它才能顯示顆粒;

當圖的屬性為analysis時,此圖只限於分析已儲存的資料包,它不能用於採集資料。

當圖的屬性為acquire-analysis時,此圖即可用於採集資料也可用於分析已有資料。

所以方便起見,我們一般將方案中的直方圖或散點圖全部設為acquire-analysis屬性。

cellquest pro cellquest

4.方案的建立

a選擇實驗引數

預設情況下,facscalibur流式細胞儀開機後只開啟一根鐳射器,及五個引數供選擇使用:fs、ss、fl1、fl2、fl3。當我們要使用第二根鐳射器及fl4通道時需要勾選fl4的選項,儀器自動開啟633nm鐳射器。

b,建立散點圖或直方圖,命名座標

cellquest pro軟體主要工作介面,軟體類似於office word的工作面,可在a4大小的頁面上進行編輯建立各種直方圖或散點圖。

在cellquest軟體下,需在選擇plot選單,選擇format來開啟圖的屬性對話方塊,其中包括了關於該圖所有選項。

建立好直方圖或散點圖後,我們需要對所選的引數進行命名,如不修改軟體自動命名為fs、ss、fl1、fl2、fl3和fl4。

在選單上選擇acquire欄目,選擇parameter description,可出現關於檔案儲存和引數命名的對話方塊。在這個對話方塊中用p字母來代表每個引數,並在此對每個採集引數進行命名,fl1為cd3fitc,fl2為cd4pe……。

c,設門並建立門與圖之間的關係

r與g的關係

r是region的首個字母,region一般是指一個閉合形的區域,如矩形區、自由區和圓形區。區域與區域之間可以進行邏輯運算,如and、or、not等關係。當區域進行運算時軟體引進了算術公式的管理概念:

gate實際了個代數式,簡稱g,其運算式預設如下:

g1 = r1,或g2=r2

當我們要進行邏輯運算時,可變更為g1=r1 and r2。此時g1就成了一個算術結果了。

g1=r1 and r2

g2=r1 not r2

g3=r1 or r2

region list管理門,可以重新命名或刪除門。gate list是對門進行邏輯運算和標識顏色的工具。

建立門與圖之間的關係

開啟要編輯的直方圖或散點圖的屬性對話方塊,選擇gate選項,選擇門即可。

d,顯示統計引數

5.儀器的操作

當計算機與流式細胞儀聯機後便會出現以下采集控制框:

在有關儀器操作所有控制選項框都在cytometer下拉選單下,同時按住「蘋果」鍵及1、2、3、4便可調取所有控制框:

6.檔案的儲存及呼叫

實驗或分析過程中所建的方案可以儲存下來,通file下拉選單可以儲存這些方案檔案:

如要開啟這些分析方案只需雙建方案圖示即可;方案可以分析以往的資料包(前提是方案中的直方圖或散點圖都已定義成acquire-analysis屬性),有兩種方案開啟以往的資料:

方法一:選擇直方圖或散點圖,開啟該圖的屬性框(plot->>format),見下圖:

在以上紅色框標註的地方選擇要分析的資料包。

方法二:選中方案中所有的直方圖或散點圖,開啟plots選單,選擇chang data file,開啟要分析的資料包。

附:cellquest pro軟體所有下接選單

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