1樓：南京金益柏生物科技****
1、冰凍切片製備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用乾淨鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定：切好片風乾後立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10 min，尤其要較長時間儲存的白片，一定要及時固定和適當儲存。
3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗**一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般 10-30 min。
5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37℃ 立即觀察，若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4℃ 30 min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然後去摸索一抗濃度和孵育時間。
最後，熒光素標記的二抗隨著儲存時間的延長，可能後有大量的遊離熒光素殘留，需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。
6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用 dapi 復染。
7、封片：為了長期儲存，我們一般用緩衝甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然後一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3 min*3 次，而一抗孵育後的清洗均為 5 次*5 min。注意：
單獨沖洗，防止交叉反應造成汙染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
pbs 的 ph 和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議 ph 在 7.4-7.
6 濃度是 0.01 m。（中性及弱鹼性條件（ph7-8）有利於免疫複合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫複合物的形成，而高離子強度則有利於分解）
9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和溼度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程式；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2 h 為宜，超過 90 min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射 3~5 min 後，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過 2~3 h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。
天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時，須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。
關閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘後；標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4℃ 儲存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。
如何做好免疫熒光
2樓：南京金益柏生物科技****
免疫熒光是標記免疫技術發展最早的一種，它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，通過將抗體與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光步驟包括，細胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，以下建議可以幫助您獲得更好的實驗結果。
1、細胞固定和通透
為達到最佳的檢測效果，細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵，細胞和抗原需要保證最佳的結構，並利於抗體與抗原結合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實現：
細胞用2%-4%多聚甲醛固定，之後用0.1%皁角苷或0.02%的triton x-100進行通透。
前者是比較溫柔的處理，但是對於核內抗原可能無效，需要用到triton。使用皁角苷進行通透時，要注意它會引起細胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外，細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。
2、抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精準定位抗原。使用只有二抗染色的**作為陰性對照，有利於減少降低背景干擾。
3、合適的抗體稀釋比例
通過優化抗體稀釋比例來優化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。
但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高訊號強度。如果是第一次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。
4、優化緩衝液和封閉劑
儘管很多抗原在常見的buffer如pbs中可以很好的被染色，但是對於某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩衝液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。rockland可提供優化過的ihc用封閉緩衝液，同樣適用於熒光染色實驗。
5、選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那麼必須使用預吸附的二抗。同時，請優先選擇來自同一物種的二抗。
6、使用合適的細胞密度
選擇合適的細胞數量進行染色，當細胞數量過多時，細胞結構不好，導致染色背景深，低細胞密度，會使細胞貼壁不佳，狀態不好。
7、多重染色
對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進行同時染色，但要求兩個一抗的種屬**不同，標記物不同，而二抗的種屬**需保持一致。
8、降低背景
高背景是免疫熒光常見的問題，解決此問題可以用二抗**的正常血清代替bsa做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數，洗滌至少三次，每次五分鐘，推薦洗滌液為pbs+0.05%tween。
9、封片
作為免疫熒光的最後一步，可以提高折射率，保護樣品。
10、資料分析
觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細胞進行資料獲取與分析。
直接免疫熒光和間接免疫熒光染色方法的異同
3樓：糖豆豆
1、接免疫熒光和間接免疫熒光染色方法的不同：
直接免疫熒光的實驗方案通常較短，因為它只需要一個標記步驟。間接免疫熒光使用偶聯二抗檢測一抗會增加額外的操作步驟。
直接免疫熒光方法的實驗方案步驟較少，更簡單。間接免疫熒光方法中必須選擇適當的二抗，增加了複雜度。這種情況在需要使用多個二抗的多色實驗中尤為突出，每個二抗需要靶向不同的物種並偶聯至不同染料。
直接免疫熒光方法中獲得的訊號與間接方法相比可能較弱，因為直接方法中沒有使用二抗進行訊號放大。免疫熒光多個二抗結合一抗可使訊號放大。
2、直接免疫熒光和間接免疫熒光染色方法的相同之處：
免疫熒光 (if) 或細胞成像技術使用抗體將熒光染料（也稱為熒光素或熒光物）標記到特異性目標抗原上，所用熒光染料有諸如異硫氰酸熒光素 (fitc) 等。而通過化學方法偶聯熒光素的抗體被廣泛使用於if實驗中。
根據熒光素與一抗還是二抗偶聯，我們將 if 方法分為兩類：直接 if-使用單個抗體，該抗體直接指向目的靶標，一抗與熒光素直接偶聯；間接 if-使用兩個抗體，一抗未偶聯，熒光素偶聯的二抗指向一抗，並用於檢測。
間接法測抗體基本原理：
染色程式分為兩步，第一步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在溼盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結合，然後洗滌，除去未結合的抗體。
第二步，加上熒游標記的抗球蛋白抗體或抗igg、igm抗體。如果第一步發生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑑定未知抗體。
4樓：天蠍神經俠侶
免疫熒光細胞化學方法的原理是根據抗原抗體
免疫熒光是什麼？
5樓：匿名使用者
免疫熒光技術（immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。
該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程式也還比較複雜。
熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性汙染，並且大多操作簡便，便於推廣。國外生產的tdm用試劑盒，有相當一部分即屬於此類，並且還有專供tdm熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產
免疫熒光的常見熒光，共定位 免疫熒光 是什麼？
1 fitc 2 rb200 3 tritc 4 鑭系 eu 抄tb 5 pe 6 其它 常見熒光素的特性bai 1 fitc 黃色結晶 du粉末，吸收光 490 495nm，發射zhi光 520 530nm，明dao亮的黃綠色熒光。2 rb200 橘紅色粉末，吸收光570nm，發射光595 600...
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