我也是做蛋白純化的,有種蛋白第一次純化時,也是非常雜,你之前又遇到過類似情況?有什麼經驗嗎 xiexie

2021-04-22 09:31:21 字數 498 閱讀 6169

1樓:養你過年吃肉

一般可溶性表達都抄會遇同類問

襲題,個人覺得有如下方面可以考慮:

仔細研究填料的說明書,同樣是his-tag或gst標籤的填料,但不同廠家,或者不同解析度,其緩衝液和洗脫濃度都是有差異的,務必注意!比如,在選擇填料時,可選擇顆粒稍微細些的填料,解析度會更好些。

在樣品的各階段都要控制雜蛋白,以最常見的his-tag,可溶表達為例,上樣時,加入低濃度(5-10mm咪唑);上樣後,多洗幾個柱體積的緩衝液及低濃度咪唑(20-50mm),更多的洗掉雜蛋白(請注意,在這個過程也會伴隨目標蛋白的緩慢洗脫,會一定程度降低得率,所以需要優化時間和濃度);再採用梯度咪唑洗脫目標蛋白。(所以,第一次用連續梯度洗脫,觀察最佳洗脫的咪唑濃度是很有必要的);

如果一種方法(如親和)經過優化,某些雜蛋白可能就是難以分離,仍不足以得到理想的純度,完全可以採用第二步純化,如離子交換,往往會達到事半功倍的效果,比你總折騰一種方法划算。

個人見解,歡迎繼續討論,祝實驗順利!

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