1樓：匿名使用者
慢病毒包裝簡要程式(以六孔板中的1孔為例)：
第一天：
1.用無抗生素dmem+10%fbs鋪板293ft細胞，2ml/孔。確保第二天細胞密度達到80%-90%融合度
第二天：
1.轉染293ft細胞。
1. 500ul opti-mem稀釋2ug pwpxld-目的基因+1.5ug pspax2+1.5ug pmd2.g
2. 500ul opti-mem稀釋15ul lipofectamine2000
3. 5min後，將，溶液混合，室溫靜止30min
4. 從6孔板中吸出1ml培養基，然後滴加入1ml質粒和脂質體混合物。
2. 6-10h後，移除含有dna-脂質體複合物的培養基，代之以正常培養液dmed+
10%fbs（從此刻開始算時間）。
第三天：
3.轉染24h後，熒光顯微鏡下觀察，轉染效率應達到70%以上
第四天：
4. 48h收穫含病毒的上清，0.45um濾膜過濾， 同時再往6孔板中加入2ml完全培養基
4. 感染細胞：用一份病毒液+2份完全培養基感染目的細胞。
第五天：
5. 72h後再次收穫病毒上清。將昨天感染的細胞離心去除上清，然後再次感染目的細胞。
6. 一般感染48h後，就能見到明顯的熒光。
2樓：吹泡泡的魚
pspxa2是可以表達慢病毒的外殼質粒，其表達產物可以通過粘附機制更易穿過細胞膜。
pmd2.5g為慢病毒的膜蛋白質粒。
pwpxld為慢病毒載體（個人理解）。
包裝好的慢病毒感染細胞後，在細胞中通過什麼啟動子來表達基因
3樓：回家種紅薯去不
慢病毒生產及使用操作手冊
一、實驗流程
製備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，共轉染293t細胞，轉染後6 h 更換為完全培養基，培養48和72h後，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
二、實驗材料
（一）慢病毒載體、包裝細胞和菌株
該病毒包裝系統為三質粒系統，組成為pspax2, pmd2g, phblvtm系列質粒。
1、載體資訊（見附錄）
2、細胞株 293t，慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培養基為dmem(含10% fbs)。貼壁細胞經培養生長增殖形成單層細胞。
3、菌株 大腸桿菌菌株dh5α。用於擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒。
三、包裝細胞293t細胞的培養
（一） 293t細胞的凍存
隨著傳代的次數增加，293t細胞會出現生長狀態下降、突變等。為了防止此類現象的出現，我們需要在開始就對細胞進行大量凍存，以保證實驗的穩定性和持續性。在細胞對數生長期進行凍存，增加細胞復甦成活率。
1、去掉上清液，加入pbs洗去殘留的培養基；
2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min後，鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，去除胰酶，加入新鮮培養基吹打混勻，移入離心管中。
3、細胞計數，將細胞全部晃下，加入 3ml 37 ℃ 預熱的 10％ dmem，用 10ml 移液管進行吹打，較大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之後，將所有細胞吸出，置於15ml 離心管中，取 50ul 混勻後的細胞於 1.5ml eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ dmem，即為 10 倍稀釋，混勻，取 10ul 細胞於計數板 中計數。計數板上共 4 大格，每大格 16 小格。
計數時，4 大格均計 數，總數除以 4（得每大格細胞數），再乘以 10（10 倍稀釋），即 為實際 n萬/ml 細胞濃度。
4、細胞離心，1000rpm，5min。去掉上清。
5、根據細胞計數結果加入細胞凍存液（70%完全培養基+20%fbs+10%dmso）,重懸細胞，密度為3 x 106個/ml。
6、分裝進細胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80℃超低溫冰箱。
7、第二天將細胞放於液氮罐中長久儲存，並作記錄。儲存過程中，要不時復甦細胞檢測細胞存活率，觀察細胞狀態等。
（二）293t細胞的傳代
當細胞生長到匯合率達到80%～90%時需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數量，維持細胞良好的生長狀態。
1、消化細胞，方法同細胞凍存。
2、細胞離心結束後，加入完全培養基重懸。
3、根據具體情況，將細胞分到10cm培養皿中，每個培養皿補足到10ml培養基。
4、將培養皿平穩放回37℃、5%co2和95%相對溼度的培養箱中培養。
（三）293t細胞的復甦
當細胞傳代次數過多，細胞狀態變差時，或者細胞出現汙染事故時，需要丟棄並對最初凍存的細胞進行復蘇。
1、設定溫度為37～42℃的水浴。
2、檢視細胞庫記錄，根據記錄從液氮罐中取出凍存的細胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中並快速晃動，儘量在1～2min內使細胞溶液完全溶解。
3、將細胞溶液轉移到15ml離心管中，並在其中加上1ml新鮮的完全培養基，混勻後離心，1000rpm，5min。
4、去掉上清，加入5ml新鮮的完全培養基，混勻沉澱後，轉入6cm培養皿。
5、將培養皿平穩放入37℃、5%co2和95%相對溼度的培養箱中培養。
6、第二天觀察細胞存活率。給細胞換一下培養基。以後每天觀察細胞生長情況。
四、慢病毒包裝和濃縮
（一）質粒擴增
構建好的慢病毒載體和輔助質粒需經過大量抽提，濃度大於1ug/ul,a260/280在1.7-1.8間方可用以包毒。推薦使用qiagen大抽試劑盒進行質粒的大量去內毒素抽提。
（二）傳293t細胞
將培養293t細胞t75瓶中的培養基吸淨，加入2ml 4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均勻覆蓋瓶底，置於37度培養箱中3-5min，取出，搖晃可發現細胞於底部脫離，將其全部晃下，加入3ml 37度水浴中預熱的10％ dmem，移液槍用10ml移液管進行吹打，較大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對準培口，小力將培養基打出即可覆蓋到接近瓶口的細胞。之後，將所有細胞吸出，置於15ml離心管中，取50ul混勻後的細胞於1.
5ml eppendorf管中，加入450ul 10％ dmem，即為10倍稀釋，混勻，取10ul細胞於計數板中計數。計數板上共4大格，每大格16小格。計數時，4大格均計數，總數除以4（得每大格細胞數），再乘以10（10倍稀釋），即為實際n萬/ml細胞濃度。
傳代當天記為第一天，若第二天進
利用攜帶目的基因的腺病毒載體感染細胞有何優勢
腺病毒載體的優點 1.宿主範圍廣,對人致病性低 腺病毒載體系統可廣泛用於人類及非人類蛋白的表達。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞，因此在大多哺乳動物細胞和組織中均可用來表達重組蛋白。特別需要指出的是 腺病毒具有嗜上皮細胞性，而人類的大多數的腫瘤就是上皮細胞 的。另外，腺病毒的複製基因和致病基因均已相當...
基因組重測序有哪些步驟？每個步驟的目的是什麼
這個問題要是能夠完美回答就沒有那麼多國內外生物學家仍在努力奮鬥了。事實上，全基因測序得到就如一本 天書 我們還是像以前那樣，比如研究某個基因，任然要做很多實驗，各個層次的，分子的蛋白的，研究基因產物的功能結構，和別的蛋白質的關係，受什麼影響，細胞定位如何 遺傳學和分子生物學 但是有了基因組測序的方便...
資料庫問題表A有欄位T1 T2 T3 T4內容分別為 AA 1 2 3 表B有欄位A1 A2 A3 A4內容分別為 AA
如果你存在ab表，那麼需要用insert into，如果不存在b表，那麼用select into db code sqlserver2005 if not exists select from sysobjects where name tab1 begin create table tab1 id...