1樓：網友
模板濃度偏高了吧。另外你需要測一下同濃度樣本重複性。
2樓：
即時螢光定量pcr技術，是指在pcr反應體系中加入螢光基團，利用螢光訊號積累即時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
pcr(聚合酶鏈式反應）是利用dna在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°c左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至dna聚合酶最適反應溫度（72°c左右），dna聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。
恆溫pcr和即時螢光定量pcr的不同，是不同在即時螢光定量pcr的系統中加入了螢光染料（sybr green 或taqman 探針等等）。以sybr green為例，這種染料可以結合在雙鏈的dna上，當pcr不斷進行時，每一次退火生成的雙鏈dna也在增加，螢光染料結合也越多，螢光也越強。在機器中有乙個探測螢光的探頭，可以定量檢測螢光的強度，轉換成數值。
這樣就可以即時記錄反映體系中dna的反應情況。
螢光pcr更有優勢，因為螢光pcr靈敏度高於恆溫pcr，同樣**也高一些。
即時螢光定量pcr和梯度pcr有什麼區別
3樓：網友
完全兩個不同的概念，梯度pcr是指你的pcr儀在設定的時候可以同一時間不同位置設定乙個從高到低的溫度梯度，以便在不知道退火溫度的情況下選擇乙個最適宜的退火溫度。二即時螢光定量pcr是通過再pcr過程中摻入螢光染料或釋放螢光基團，從而對模板進行相對定量或絕對定量的實驗，在即時螢光定量pcr時也可以設定梯度，總的來說即時螢光定量pcr是一種實驗方法，而梯度pcr是一種實驗手段。
4樓：南京金益柏生物科技****
做標準曲線至少要5個梯度才好，梯度越多獲得的標準曲線越可靠。你的實驗，做了六個梯度，自己感覺兩個不好四個好，這種想法太主觀，至少要尊重實驗的結果。總得說起來六個梯度做出來的結果不符合標準的話，那說明你的實驗體系還是有問題的，還需要再調整。
為什麼螢光定量pcr可以準確定量
5樓：匿名使用者
準確定量。
即時定量的引物設計要求比較高，可以按普通引物設計的方法來做，但是設計時要注意擴增的片段不能太大，最好在250bp-100bp之間。同時要保證這對引物有絕對的特異性，因為要是產生非特異性擴增的話，就不能準確的計量模板量了，這樣就失去了即時定量的意義了。
用已知濃度的dna樣本（通常是質粒）梯度稀釋成一系列的樣本。做實驗的時候，這些標準品和待測樣本加在同樣一塊96孔盤的不同孔內。一起做pcr。
標準品的螢光強度和已知的濃度作圖，可以得到一條標準曲線。而待測樣本的螢光強度測出以後，就可以在標準曲線上算出樣本濃度了。
即時螢光定量pcr中的絕對定量怎麼做
6樓：奔馬的香香豬
在pcr反應體系中加入螢光基團，利用螢光訊號積累即時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析。隨著pcr反應的進行，pcr反應產物不斷累計，螢光訊號強度也等比例增加。我們實驗室用biog-pcr技術測得的擴增曲線起跳值一般在30左右，每經過乙個迴圈，收集乙個螢光強度訊號，這樣我們就可以通過螢光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條螢光擴增曲線圖。
螢光定量pcr擴增效率曲線怎麼做
7樓：網友
根據模板的**不同選擇不同的標準品，且濃度已知。標準品可以自己製備也可以購買。
然後在進行定量的時候對標準品進行濃度梯度稀釋（5倍/8倍/10倍），由於ct值跟濃度的負對數存**性關係，所以根據ct值和已知的濃度畫出標曲。一般情況下機器會自動給出標曲。
做實時熒光定量PCR實驗時，為什麼做標準曲線
最好是做標準曲線,要看看擴增效率的.調cdna就還了 我是熒光定量pcr初學者，現在想做定量試驗，最近做了個標準曲線，可是內參和目的基因的點都不 上。可以78 讀板，這樣ct值就只是產物的值了，另外你的ntc可能是汙染了，稀釋的過程中也要防止汙染，尤其是標準品，從溶解曲線上看，確實有非特異性的擴增，...
實時熒光定量PCR擴增actin溶解曲線怎麼兩個峰
兩個峰長什麼樣？是挨在一起的還是離的很遠的？縱座標最高峰是多少？是同一個峰出現一個小缺口的樣子嗎？如果可以請將原圖傳上 誰能具體解釋一下熒光定量pcr中溶解曲線的意思以及作用 溶解曲線分析可以用來確定不同的反應產物，包括非特異性產物。溶解曲線分析可以用來確定不同的反應產物，包括非特異性產物。擴增反應...
我要用CT法做熒光定量PCR，請問需要做標準曲線嗎？關於濃度
最好是做標準曲線，要看看擴增效率的。調cdna就還了 不需要做標準曲線吧?我沒有調rna濃度，你調了也作用不大，畢竟你做反轉錄是mrna的反轉錄，你如果調總rna的濃度也沒多大用啊。如果是mrna濃度調到一致還是可以的。請問做熒光定量pcr時每次都需要做標準曲線嗎？謝謝！絕對定量只要做一個就行。相對...