1樓：南京金益柏生物科技****
細胞爬片免疫熒光實驗步驟
第一天：
1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用pbs浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， pbs浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%triton x-100( pbs配製 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；
4. pbs浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸乾pbs，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗並放入溼盒，4℃孵育過夜；
第二天：
6. 加熒光二抗： pbst 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸乾爬片上多餘液體後滴加稀釋好的熒光二抗，溼盒中20-37℃孵育1h，pbst浸洗切片3次，每次3min；
注意：從加熒光二抗起，後面所有操作步驟都儘量在較暗處進行。
7. 復染核：滴加dapi避光孵育5min，對標本進行染核，pbst 5min×4次洗去多餘的dapi；
8. 用吸水紙吸乾爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然後在熒光顯微鏡下觀察採集影象。
求助 細胞免疫熒光的詳細操作步驟
2樓：匿名使用者
1，取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養皿裡，pbs洗三遍。注意有的時候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心。
2，4%多聚甲醛固定20分鐘，pbs洗三遍。
3，0.2%triton x 100通透10分鐘，pbs洗三遍。
4， 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，pbs洗三遍。
5.，一抗4度溼盒內過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，pbs洗三遍。
6，二抗室溫2小時，或者37度1半小時，pbs洗三遍。
7，最好用dapi染核，然後直接照熒光片。
8，蒸餾水洗掉pbs，甘油封片，指甲油封**的四周。
求助：細胞膜蛋白免疫熒光染色問題
3樓：匿名使用者
1、問:用免疫熒光方法做組織切片和培養細胞內的蛋白，兩者操作過程有哪些不同?
參考見解:只是固定方法不同。細胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。
2、問:近期要做免疫熒光雙標，不知哪位有免疫熒光雙標技術的詳細步驟及其注意事項?
參考見解:我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經驗是:
(1)選取一抗時要**於兩種不同的動物，我用的是**於rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光訊號標記的，我用的是donkey anti-rabbit-fitc(綠)和donkey anti-rat-tex-red(紅)。
(2)我的做法是兩種一抗（chi抗體）同時孵育，然後兩種二抗同時孵育。抗體濃度、孵育時間要仔細摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。
(3)我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的igg，熒游標記物對照是pbs+熒游標記物。
(4)封閉血清與二抗**動物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
(5)其餘步驟同一般免疫熒光單標操作。
3、問:本人擬做brdu標記神經幹細胞免疫熒光，二抗為fitc標記，想請教各位大俠:
(1)抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時是否一定要在暗室中進行?
(2)封片時是否用甘油緩衝液即可，還是用甘油和0.5mmol/l ph9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液等量混合封片?
(3)免疫酶染色中的3%過氧化氫及2n鹽酸是否還需要用?
參考見解:
(1)你的二抗是用fitc標記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/l ph9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液，後者能使玻片透明;
(3)關於免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標記，就必須用3%h2o2以去除內源性過氧化物酶;2n鹽酸需要使用，目的是使dna變性，讓brdu抗體能夠充分地與已經摻入的brdu結合。
4、問:做間接法免疫熒光染色，如何設定對照?
參考見解:最好是同一視野在未用熒光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
(1)空白對照:如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個對照必須有，目的是看自發熒光，脫蠟後直接在熒光顯微鏡下觀察。
(2)陰性對照:標本直接滴加二抗，呈陰性反應。
(3)抗原對照:標本加同種動物的未免疫血清，以pbs沖洗後，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。
5、問:我做乳腺組織的免疫熒光染色，結果用鐳射共聚焦顯微鏡看很好:有陽性訊號，陰性對照組也沒有熒光，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個結果才是真實的呢?
參考見解:鐳射共聚焦顯微鏡的解析度比普通熒光顯微鏡要高的多，出現上述現象首先要排除熒光顯微鏡的問題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒有問題，那就以共聚焦顯微鏡的結果為主。
關於細胞免疫熒光染色的問題
4樓：匿名使用者
(1)你的二抗是用fitc標記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/l ph9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液，後者能使玻片透明;
(3)關於免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標記，就必須用3%h2o2以去除內源性過氧化物酶;2n鹽酸需要使用，目的是使dna變性，讓brdu抗體能夠充分地與已經摻入的brdu結合。
做間接法免疫熒光染色，如何設定對照?
參考見解:最好是同一視野在未用熒光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
(1)空白對照:如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個對照必須有，目的是看自發熒光，脫蠟後直接在熒光顯微鏡下觀察。
(2)陰性對照:標本直接滴加二抗，呈陰性反應。
(3)抗原對照:標本加同種動物的未免疫血清，以pbs沖洗後，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。
免疫熒光，免疫熒光雙標，求助
5樓：
免疫熒光法雙標法我自己到沒做過，不過我一同學在威斯騰生物做過免疫熒光雙標
求助免疫熒光的結果分析,求助免疫熒光PI染核問題
可以用image pro plus分析灰度 求助免疫熒光pi染核問題 細胞試驗指南上dapi染核是在孵育完二抗之後，估計pi也可以在這時加。在論壇中查到的濃度不一，有10 50 m，有5ug 20ug ml,作用時間有5 30min不等，染完後pbs洗3遍，封片。用535 nm激發波長，615 nm...
求助免疫熒光雙標染色方法,請教免疫熒光雙標中熒光二抗的選擇是否合適
建議樓主產看文獻 link?url zf7lnaeihra 1uj00sxtt9ywo1 mvbhkml t2sfeyq4zojisfkchnn wtk3cslht0avucljxdbkwk6jg6efkqyb qpsjbfaiuqi13l h703 這個文獻可以參考下 請教免疫熒光雙標中熒光二抗的...
免疫熒光的標本怎麼製作,免疫熒光染色的詳細步驟及應注意的細節
免疫熒光的標本製作的基本程式和dab顯色的組化類似 1 免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同2 免疫熒光的二抗使用不同熒游標記的二抗孵育，孵育時間根據抗體的工作濃度確定 3 二抗孵育之後充分洗片後即可貼片 封片和觀察4 免疫熒光在封片使用專用封片劑 如果你經費比較充足 或甘油 0....