蛋白質之間相互作用的研究方法有哪些

2021-03-03 20:49:23 字數 4943 閱讀 8310

1樓:匿名使用者

研究dna-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括:a、凝膠阻滯實驗; b、dnase 1 足跡實驗;c、甲基化干擾實驗; d、體內足跡實驗; f、拉下實驗。研究蛋白質/ 核酸相互作用近期採用的新技術有:

核酸適體技術、生物資訊學方法、蛋白質晶片技術以及奈米技術等。

蛋白(綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白)的載體中,共轉染到功能細胞中(一般選用 cos7 細胞)表達帶有熒光的融合蛋白.這樣,相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光,可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測.在進行精確細胞定位或共定位時,必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測.

因為共聚焦熒光顯微鏡(相當於醫院給病人診斷的 ct)觀測的是細胞內一個切面上的顏色.如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色,就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用.普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象,無法確定蛋白質共定位現象.

在進行定位或共定位同時,也可以對細胞核進行染色.這樣,在細胞中就有三種顏色.細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置.

上面介紹的活細胞定位,其優點是表達的熒光蛋白熒光強,沒有背景,觀測方便.

研究蛋白質之間相互作用的實驗方法有哪些?

2樓:匿名使用者

白質與蛋白質之間相互作用構成了細胞生化反應網路的一個主要組成部分,蛋白-蛋白互作網路與轉錄調控網路對調控細胞及其訊號有重要意義。把原來spaces空間上的一篇蛋白質與蛋白質間相互作用研究方法轉來,算是實驗技巧分類目錄的首篇。

一、酵母雙雜交系統

酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後,誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子,啟動報道基因在酵母細胞內的表達,如果檢測到報道基因的表達產物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化後則可用於大規模蛋白質之間相互作用的研究。

在實際工作中,人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。angermayr等設計了一個sos蛋白介導的雙雜交系統。可以研究膜蛋白的功能,豐富了酵母雙雜交系統的功能。

此外,酵母雙雜交系統的作用也已擴充套件至對蛋白質的鑑定。

二、噬茵體展示技術

在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連線一單克隆抗體的dna序列,當噬菌體生長時,表面就表達出相應的單抗,再將噬菌體過柱,柱上若含目的蛋白,就會與相應抗體特異性結合,這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用,不僅有高通量及簡便的特點,還具有直接得到基因、高選擇性的篩選複雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。目前,用優化的噬菌體展示技術,已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cdna文庫,並分離出了人上皮生長因子訊號傳導途徑中的訊號分子。

三、等離子共振技術

表面等離子共振技術(su***ce pla**on resonance,spr)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種奈米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」,當待測蛋白與誘餌蛋白結合後,薄膜的共振性質會發生改變,通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。spr技術的優點是不需標記物或染料,反應過程可實時監控。

測定快速且安全,還可用於檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。

四、熒光能量轉移技術

熒光共振能量轉移(fret )廣泛用於研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結合,可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、dna 和rna 的時空資訊。隨著綠色熒光蛋白(gfp)的發展,fret 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量fret效率以及供體與受體間距離的簡單方法,僅需使用一組濾光片和測量一個比值,利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。

該方法簡單快速,可實時定量測量fret 的效率和供體與受體間的距離,尤其適用於基於gfp 的供體受體對。

五、抗體與蛋白質陣列技術

蛋白晶片技術的出現給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態下蛋白水平的量變,微型化,整合化,高通量化的抗體晶片就是一個非常好的研究工具,他也是晶片中發展最快的晶片,而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶片有的已經在向臨床應用上發展,比如腫瘤標誌物抗體晶片等,還有很多已經應用再眼就的各個領域裡。

六、免疫共沉澱技術

免疫共沉澱主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用[/url]的一種技術,其基本原理是,在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體,孵育後再加入與抗體特異結合的結合於pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白a(spa),若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白,就可以形成這樣一種複合物:「目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—spa\|pansobin」,因為spa\|pansobin比較大,這樣複合物在離心時就被分離出來。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳,複合物四組分又被分開。

然後經western blotting法,用抗體檢測目的蛋白是什麼,是否為**蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的,符合體內實際情況,得到的蛋白可信度高。但這種方法有兩個缺陷:

一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋樑作用;二是必須在實驗前**目的蛋白是什麼,以選擇最後檢測的抗體,所以,若**不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。

七、pull-down技術

蛋白質相互作用的型別有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白複合體常見,最好通過免疫共沉澱(co-ip) 、pull-down技術或far-western法研究。pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標籤蛋白(生物素-、polyhis-或gst-),從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。

通過pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關係,從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關係。

研究蛋白質之間相互作用的實驗方法?

3樓:匿名使用者

白質與蛋白質之間相互作用構成了細胞生化反應網路的一個主要組成部分,蛋白-蛋白互作網路與轉錄調控網路對調控細胞及其訊號有重要意義。把原來spaces空間上的一篇蛋白質與蛋白質間相互作用研究方法轉來,算是實驗技巧分類目錄的首篇。

一、酵母雙雜交系統

酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後,誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子,啟動報道基因在酵母細胞內的表達,如果檢測到報道基因的表達產物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化後則可用於大規模蛋白質之間相互作用的研究。

在實際工作中,人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。angermayr等設計了一個sos蛋白介導的雙雜交系統。可以研究膜蛋白的功能,豐富了酵母雙雜交系統的功能。

此外,酵母雙雜交系統的作用也已擴充套件至對蛋白質的鑑定。

二、噬茵體展示技術

在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連線一單克隆抗體的dna序列,當噬菌體生長時,表面就表達出相應的單抗,再將噬菌體過柱,柱上若含目的蛋白,就會與相應抗體特異性結合,這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用,不僅有高通量及簡便的特點,還具有直接得到基因、高選擇性的篩選複雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。目前,用優化的噬菌體展示技術,已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cdna文庫,並分離出了人上皮生長因子訊號傳導途徑中的訊號分子。

三、等離子共振技術

表面等離子共振技術(su***ce pla**on resonance,spr)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種奈米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」,當待測蛋白與誘餌蛋白結合後,薄膜的共振性質會發生改變,通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。spr技術的優點是不需標記物或染料,反應過程可實時監控。

測定快速且安全,還可用於檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。

四、熒光能量轉移技術

熒光共振能量轉移(fret )廣泛用於研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結合,可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、dna 和rna 的時空資訊。隨著綠色熒光蛋白(gfp)的發展,fret 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量fret效率以及供體與受體間距離的簡單方法,僅需使用一組濾光片和測量一個比值,利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。

該方法簡單快速,可實時定量測量fret 的效率和供體與受體間的距離,尤其適用於基於gfp 的供體受體對。

五、抗體與蛋白質陣列技術

蛋白晶片技術的出現給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態下蛋白水平的量變,微型化,整合化,高通量化的抗體晶片就是一個非常好的研究工具,他也是晶片中發展最快的晶片,而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶片有的已經在向臨床應用上發展,比如腫瘤標誌物抗體晶片等,還有很多已經應用再眼就的各個領域裡。

六、免疫共沉澱技術

免疫共沉澱主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用[/url]的一種技術,其基本原理是,在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體,孵育後再加入與抗體特異結合的結合於pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白a(spa),若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白,就可以形成這樣一種複合物:「目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—spa\|pansobin」,因為spa\|pansobin比較大,這樣複合物在離心時就被分離出來。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳,複合物四組分又被分開。

然後經western blotting法,用抗體檢測目的蛋白是什麼,是否為**蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的,符合體內實際情況,得到的蛋白可信度高。但這種方法有兩個缺陷:

一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋樑作用;二是必須在實驗前**目的蛋白是什麼,以選擇最後檢測的抗體,所以,若**不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。

七、pull-down技術

蛋白質相互作用的型別有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白複合體常見,最好通過免疫共沉澱(co-ip) 、pull-down技術或far-western法研究。pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標籤蛋白(生物素-、polyhis-或gst-),從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。

通過pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關係,從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關係。

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